基因工程：原理、应用及其社会影响

 

华南师范大学  生命科学学院  李德红

lidh@scnu.edu.cn

（Guangzhou, 2007-09-23）

 

一、       基因工程的基本原理简介

 

基因工程又称基因操作、重组DNA技术，是P. Berg等于1972年创建的。

简单地说，就是按照人们的愿望进行DNA分子设计，通过体外重组DNA和转基因等，使生物具有符合人们需要的、新的生物特性。

基因工程是建立在分子遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学的基本原理和知识的基础之上的应用性科学。

•两个基本特点

分子水平上的操作

细胞水平上的表达

•基因工程诞生的两方面条件

•基础理论的突破

DNA carries genetic information

DNA double helix

Central dogma—Information Flowing

Genetic codon

•实验技术的进步

Plasmids—基因转移载体

限制酶、连接酶和逆转录酶—工具酶

DNA synthesis & sequencing

体外DNA重组及表达

PCR技术

…

•包含内容：

基因工程的酶学基础

基因工程操作的基本原理和基本技术

基因的分离、鉴定和基因表达的基本程序和原理

 

•基本思路 /程序 /步骤：简化为：“切、连、转、选”。

获得目的基因

将目的基因构建在同一个表达载体上

将其导入目标植物（或动物）中

经PCR扩增和Southern杂交分析，检测（外源）目的基因是否已整合到该植物（或动物）的基因组中

 

•基因工程的基本步骤和技术要点

——以淀粉合成酶基因转入小麦、b-胡萝卜素基因转入水稻为例

 

1. 目的基因的获取

                                                            “切”

•    目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。

•    目的/动机：          从现实生活中(的问题) 来

           

淀粉合成酶基因转入小麦：干扰、抑制某些合成途径，调整麦粒的淀粉合成途径(的比例)，改变淀粉的组成、结构，改善面粉的品质。

b-胡萝卜素基因转入水稻：使稻谷籽粒也能合成b-胡萝卜素，提高稻米的(营养)价值。

 

•     目的基因的获取方法 /技术

                        PCR扩增 –已知基因，且了解(部分)序列特征

                        基因文库 –已有文库，且知道相关基因的特性

                        人工合成 –已知基因序列，且较短

PCR技术是核心

PCR [Polymerase Chain Reaction]的条件

模板DNA、引物对、反应缓冲液、反应底物、耐高温的DNA聚合酶等。

引物合成：根据欲扩增的DNA片段的3’-和5’-端的碱基序列特征来设计。一般18-23 bp，Tm＝58-65 oC。

 

PCR的原理

高温变性 （95 oC）è 低温退火 （引物能够稳固结合上去，但原有模板DNA双链不能复性）è 适温延伸 （72 oC，指数扩增：PCR产物DNA的量约为2n）。PCR产物(DNA片段)长度一般200-1000 bp，多数约500 bp。

 

PCR的程序 （示例）

1

95 oC

15 min

35
 
 

94 oC

30 s

 

60 oC

45 s

 

72 oC

1 min

1

72 oC

10 min

 

25 oC

1 min

 

•DNA分子的切割与连接

KEY POINT： PCR扩增得到的外源基因(DNA片段)和质粒载体用相同的内切酶加工成切口一致的片段。

 

•        限制性核酸内切酶（工具酶之一）

可把基因组DNA切成不同大小的片断

                  ——基因组DNA片断化

识别特异的碱基序列，将DNA长链切割成为“接口”相互吻合的短片段

                  ——适于连接（外来）DNA片段

酶切位点：回文序列和镜像重复序列

•        连接酶

 

2. 构建表达载体 /质粒

                                                “连”

考虑：

外源 /目的基因有何特点和要求？

使外源基因表达或抑制基因的表达

将构建符合要求的DNA片段（insert DNA），连接到相应的空载体（Vector）中去。需要连接酶和相应的反应缓冲液、ATP、DTT和适当的温度等条件。

 

3. 目的基因导入受体细胞

                                                “转”

•    相关概念

遗传转化：通过某种途径（或技术）将外源基因导入受体细胞的基因组中,并使之在受体细胞中表达。

•    外源基因导入受体细胞的方法有多种，根据是否采用基因载体为介导，可归纳为两类：

农杆菌介导的遗传转化

基因（DNA）的直接导入

导入植物细胞的方法，如：化学共培养法（PEG）（Lorz等，1985）；子房注射法（Dela Pena等，1987）；种胚吸收DNA法（Topfer等，1989）；花粉管通道法（Luo and Wu，1988）；碳化硅纤维法（Kaeppler等，1990）；组织电击法（D’Halluin，1992）和基因枪法（Sanford等，1988）。

＋导入动物细胞、微生物细胞

 

•    基因枪法基本原理：

    结合有DNA的金属微粒被称之为微载体或微弹，携带载有微弹的尼龙或塑料弹头被称之为载体或微弹载体。

    基因枪利用火药爆炸、高压放电引起水滴气化或高度压缩的(氦气、氮气或其它)气体的爆炸性释放产生的动力。驱动载有微弹的微弹载体高速运动（328－656 m/s）。当微弹载体抵达弹膛时被带有穿孔的挡板所拦截，而微弹由于惯性作用继续高速运动并击中靶细胞。

根据其动力的不同，可分为

火药式基因枪  PDS－1000系统（杜邦公司，1990）

                       JQ-700型基因枪（中科院生物物理所）

                       如：洋葱、烟草、水稻、玉米和小麦

放电式基因枪   如：大豆

气动式基因枪 PDS-1000/He （Bio－Rad公司） 如：玉米

农杆菌介导的遗传转化

•          单子叶植物的遗传转化受农杆菌寄主的限制

    解决方案？–e.g. 加辅助菌

将已构建好的细菌质粒大片段（含目的基因及相应的启动子、终止子、标记基因等）转入经改造的农杆菌质粒中，再经(三亲本)共培养【triparental mating，三亲本交配】，将外源基因转到受体细胞中去。

组织培养与植株再生

将转入了含有目的基因的细胞/愈伤组织在适当的培养基和选择压力下进行组织培养，经成芽诱导、生根诱导等，获得再生植株。

 

4. 目的基因的检测与鉴定

                                                “选”

实际上，每个步骤都包含此内容：

检测，筛选到含有目的基因的菌株，进行后续操作。

如，

“切”：电泳PCR产物，看片段大小所否吻合。

“接”：再酶切，大小与设计的一致。再测序，确保所有序列正确。

“转”：检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在和“正常”